SEM扫描电镜样品制备基本原理及方法
发表时间：2015-08-03 点击次数：6674
SEM扫描电镜样品制备基本原理及方法
常规电镜样品要求：必须是干燥的，不含水分或挥发性物质；具有一定机械强度，能耐受电子束轰击；具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。
生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小；组成元素的原子序数低，导电性差，激发后二次电子的产额较少。
制样的任务：通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态，又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。
SEM样品的常规制备技术；特殊要求的扫描制样技术。
图1 扫描电镜样品的常规制备技术
取材
即：获取观察材料。遵循五字原则：准、轻、小、净、浓。
1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。
2.动作轻巧：保护好拟观察面。
解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。
3.厚度小：满足观察条件的最小体积，厚度为1~2毫米
4.纯净防混杂：花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂
5.悬浮液样品要求合适的浓度：浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。
清洗
1.完整的制样程序中有三次清洗
固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物，确保获得清洁的观察表面。
前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸反应而削弱锇酸的固定效果。
脱水前的清洗：洗净固定液，以免与脱水剂反应产生沉淀影响观察效果。
2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；
覆盖大量黏液的样品(胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗；
组织培养细胞：用相应的培养液清洗；
特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的甘油和20%乙醇浸泡清洗；
表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。
3.清洗方法：不同材料采用不同方法，灵活应用
（1）植物材料：根部水冲洗去泥土，地上部用水冲洗或滴洗。观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。
（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。
（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。
（4）游离细胞、微生物：离心法清洗。
（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率
（6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、组织液凝聚而影响观察效果。通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力
固定方法
1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽熏蒸固定0.5~1小时。
3.双固定：戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
脱水：梯度系列脱水法。
注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。
干燥
指除去样品中的残存液体（水或脱水剂），使样品中不含液态物质的过程。
原因：液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力，其反作用力会使样品表面结构产生形变。
1.自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发使样品干燥。
适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼；游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。
特点：经济便捷。
2.真空干燥法：含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内，抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。
特点：干燥速度快，效果与自然干燥法相近。
3.冷冻干燥法：超低温快速冷冻
取材→固定→脱水→制冷剂→真空升华→粘样
样品干燥法
4.临界点干燥法（critical piont drying method CPD)
(1)干燥原理：
在密闭容器中加热，使液态干燥剂变为气态，当气态与液态物质的密度相等时，相界消失。这时液态干燥剂的分子内聚力为零，此时液体的表面张力系数为零(即临界状态)。在临界状态下继续对容器加热，同时以一定速度排出气体，直到排净为止。这时样品在无表面张力的临界状况下得以干燥。
图2 扫描电镜样品制备干燥原理
使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度。
使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强.
临界点干燥法
（2）常用干燥剂与中间剂：
干燥剂：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体
常用干燥剂：
液态CO2：临界温度为31.1℃，临界压强72.8标准大气压。
F12：临界温度28.9 ℃，临界压强38.1标准大气压。
中间剂：既可以与干燥剂，又能与脱水剂相溶的液体，先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。
常用中间剂：醋酸异戊脂，醋酸戊脂。
(3)干燥步骤：
第一步：中间剂置换脱水剂：2次/10~15分钟；
第二步：干燥剂置换中间剂：2次/10~15分钟；
第三步：干燥剂进入临界状态并维持临界状态排尽干燥剂。
图3 透射电镜样品制备干燥步骤图
(4)注意事项：
•放置样品前要预冷样品室，以免过早汽化影响效果；
•必须保证干燥剂的纯度以免污染样品；
•控制排出气体速度，必须保持在临界状态下排净气体；
•样品室温度回到室温，压力回到零后方可开取样品；
•干燥好的样品要防止回潮，要妥善保存。
5.有机溶剂干燥法
利用某些有机溶剂凝固点较高的特性，对样品进行干燥。
常用有机溶剂：叔丁醇、乙腈、莰烯
纯水：结晶点为0 ℃，再结晶点为-130 ℃
叔丁醇：凝固点为24~25.5℃，10 ℃时全部固化；
莰烯：凝固点为40℃
干燥方法：
图4 扫描电镜样品制备之干燥方法
六、粘样
利用粘接剂把样品固定在样品托上
1.目的要求：
•保证样品在样品托上的稳定性；
•增强样品与样品托之间的导电性，观察时表面不造成电荷堆积而发生放电现象。
2.常用粘接剂：银粉导电胶、碳粉导电胶、双面胶带。
3.粘样方法：保护观察面
•导电胶：用于粘贴大块样品（组织块）；
•双面胶带：用于花粉类细小易分散的样品；
•不粘贴：细菌、血液等单细胞直接滴在样品托上；
•胶水：果壳、种子等较大颗粒的样品。
七、镀膜：在样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜
要求：镀膜必须薄而均匀，本身无结构，能够再现样品表面的固有形态，化学性质稳定，不与样品发生化学反应。
目的：改善生物样品的导电性；提高二次电子的产额，改善图像的反差、亮度、分辨率，从而改善了图像的质量；并增强了样品的机械强度。
1.离子溅射镀膜法：金、铂、金—钯、铂—钯合金
（1）镀膜原理：抽低真空，加负高压，残留气体分子电离，撞击靶金属产生粒子，粒子受电场作用飞向阳极落在样品表面。
图5 扫描电镜样品制备之镀膜原理
应用：微生物样品的处理
细菌：
液体培养基的菌落→8000离心2~5分钟→常规固定脱水干燥粘样镀膜；
固体培养基的菌落→先滴固定液→刮下菌落→8000离心2~5分钟→常规固定脱水干燥粘样镀膜；
霉菌：
切割菌落→戊二醛固定→常规脱水干燥
