亲和层析纯化的抗HRP及其耦联物的抗体可以用来检测HRP或者放大含有HRP试剂的效果。哺乳动物细胞的免疫染色中。因此这个抗体的优势就是可以降低背景。由于抗HRP抗体不识别内源性的过氧化物酶的类似酶。A minomethylcoumarinAcetatAMCA

 

耦联的AMCA 吸收光波长最大为350nm发荧光则为450nm对于荧光显微镜来说。用紫外滤板来观察。由于AMCA 信号相对较弱，AMCA 可以用汞灯来激发。单标实验中不推荐使用AMCA AMCA 和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，多标记的实验中，AMCA 耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA 和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。如果使用在流式细胞仪中，AMCA 可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它发出的光线是光谱的紫外区。

 

FluoresceinIsothiocyanFITC

 

耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm发射的最大波长为520nm由于FITC被使用了很长时间而且产量很大。因此要和抗淬灭剂一起使用。DTA F荧光素的一个衍生物，FITC被广泛应用。荧光素的最大缺点是淬灭快。激发和发射波长均和FITC相同。当和链霉亲合素耦联时，因为荧光强度上有明显的区别，最好不使用FITC而使用DTA F

 

CyanindyeCy2.Cy5 Cy3.

 

Cy2耦联基团激发波长为492nm发光为波长510nm绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂。染色片贮存后会导致荧光微弱和扩散。因为这种抗淬灭剂和Cy2反应。

 

背景更弱。荧光显微镜的Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm最强发射光为570nm因为激发光和发射光波长很接近PITC,更稳定。Cy3和Cy5比其他荧光团探针要更亮。荧光显微镜中，可使用和PITC一样的滤波片。

 

氦氖灯（543nm或者汞灯（546nm下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。 Cy3氩光灯（514nm或528nm下可以被激发出50％的光强。

 

Cy5耦联基团的激发波长最大650nm发光波长最大670nm氪氩灯（647nm下它可被激发出98％的荧光。而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用保守的外表荧光显微镜时，氦氖灯下（633nm为63％。Cy5可以和很多其他荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它最大发射波长在670nmCy5很难用裸眼观察。不推荐使用Cy5

 

TetramethylRhodaminIsothiocyanPITC

 

TexaRedP RhodaminRed-XRRX.

 

RRX尤其有用，可以和Cy2或者FITC和Cy5一起使用，因为RRX发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm598nm和647nm分别是Cy2FITC,使用RRX和P可以得到更好的颜色区分。使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时。这些若丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 550,570,596nm和最大发射波长（570,590,620nm尽管PITC经常和FITC一起在双标记实验中使用。RRX和Cy5理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发,流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE耦联基团要比若丹明好，

 

总结下来

 

荧光团探针的选择有两个重要标准：

A. 荧光显微镜的光源，滤片，检测系统。

B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。

 

 例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。

C. 灵敏度。比如，Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。