冷冻固定

在制备生物样品时，人们希望在保存样品结构的同时尽可能接近生物体生活状态。实验证明，冷冻固定能够迅速固定样品，减少细胞内物质丢失，使得生物大分子结构及酶的活性均可得到良好保存。

 

我们知道样品本身内部水分会破坏电子显微镜高真空，而电镜高真空对样品内部水分的影响也会破坏生物样本的超微结构。因此在观察生物样本前需要用化学方法将水分彻底去除或采用冷冻方法使之固定不动。

 

本次我们将着重讲解冷冻固定，分别从冷冻固定原理、冷冻固定特点、冷冻剂以及防冻剂的选择、冷冻固定方法展开。

 

         

1.    冷冻固定原理

 

在生物体内，水分以游离态和结合态两种状态存在。在缓慢降温过程中，水分由液态变为固态冰，体积膨大，破坏细胞超微结构。后续研究中发现，当冷冻速度极快时，细胞内的水分不形成固态冰而变为一种玻璃态，玻璃态的水是一种无定形的，没有任何冰晶的冷冻状态，不会破坏细胞超微结构，有效地保存了细胞内生物大分子以及酶的活性。

冷冻固定与冷冻速度和样品厚度有关。在保证样品尽可能薄的情况下，冷冻速度的快慢与冷冻剂的选择、是否添加防冻剂以及冷冻固定方法等有关。

2.    冷冻固定特点

 

优点：

 

1）组织在0.1-1ms范围内被迅速固定，能够捕获细胞瞬间动态变化过程，如膜的融合、细胞的内吞和胞吐、纤毛的摆动等，对于深入研究其动态结构与功能十分重要；

 

2）结构丢失少，超微结构保存良好，避免蛋白质变性，保持酶和抗原活性；

 

3）未经过长时间样品处理，样品结构中出现假象少且假象易于解释；

 

4）对于冷冻后样品可直接进行冷冻切片而不需要经过繁琐的样品处理步骤。

 

缺点：

 

冷冻固定过程中如若操作失误，很容易出现冰晶，损伤样品。

 

3.    冷冻剂选择

 

样品冷冻速度快慢与冷冻剂种类和性质有关，好的冷冻剂应具有低熔点、高沸点、高热容量、良好的热传导性、低温下高流动性等特点，另外还需要考虑安全性以及价格等因素。常见的冷冻剂有：液氮、液体丙烷、液体乙烷等。

 

种类    温度       缺点

液氮  -196℃    产生气体隔层，降低冷冻速度

液体丙烷 187℃  易燃易爆

液体乙烷 -171℃  易燃易爆

 

因此，一般用液氮作为间接冷冻剂，采用液氮冷冻丙烷，样品插入丙烷中冷冻的方式。

 

另外，液氮泥也是一种很好的冷冻剂，既安全又廉价，冷冻时也不会产生气体隔热层，冷冻速度可达到-1700℃/s。

 

4.    防冻剂选择

 

为防止或减少样品在冷冻过程中产生冰晶，造成细胞超微结构的损伤，某些样品在进行冷冻固定前通常需进行防冻处理，促进样品冷冻的同时，保证细胞结构的良好保存。目前常用的防冻剂有：甘油、二甲亚砜、蔗糖等。

 

种类              特点

 

甘油            渗透性动物组织大于植物组织，但可改变膜透性，引起微管重新排列，可能使细胞产生假象。使用浓度一般为10%-30%。

 

二甲亚砜          渗透组织速度比甘油快，但对膜破坏强，需慎重使用。

 

蔗糖                    组织用PH为7.0-7.4的1.6-2.3moL/L蔗糖浸泡，不但能防止冰晶产生，还能增加组织柔软性，利于后续冷冻切片。

 

另外，Echlin et al.，1977曾报道，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖也是防冻剂，是非渗透性的高分子聚合物，与同浓度甘油相比，对细胞和组织毒性小，PVP使用浓度一般为15%-25%，但可引起细胞收缩。因此使用时应精准调节渗透压及PH值。

 

实验中，为达到预防效果，可使用混合防冻剂，如牛血清与蔗糖混合、10%甘油与20%蔗糖混合等。

 

5.    冷冻固定方法

 

1）常规冷冻固定

 

将样品经过化学固定剂固定后，浸泡在防冻剂中进行防冻保护，最后在冷冻剂，如液氮、液体丙烷中等冷冻。注意样品厚度最好不超过0.5mm。例如Tokuyasu技术，样品经过化学固定剂固定后，放在2.1~2.3moL/L蔗糖中，室温放置2h以上，然后放置液氮中冷冻后进行冷冻超薄切片，将切片放置于2.3moL/L蔗糖液滴中，解冻后进行免疫标记或者染色观察等。

2）特殊冷冻固定

 

①   插入式冷冻法：通过手动或借助辅助装置或利用重力驱动装置，将样品插入冷冻液中，使样品在毫秒时间内达到玻璃态。该方法操作简单，花费少，应用广。实验通常采用液氮间接冷冻液体丙烷的方法，使液体丙烷温度维持恒定。注意样品尺寸应小于0.3mm3。

 

②   高压冷冻法：利用高压冷冻仪器，将样品进行快速冷冻固定。样品可在30ms内同时达到173K和2100Pa，有快速冷冻周期，具有适合不同尺寸样品的样品台，固定深度可以为200um，最高可达600um。但是不足之处是样品在高压的作用下会受到损伤，受损伤程度与压力大小和作用时间长短成正相关，且高压冷冻仪器价格昂贵。

 

在实验过程中，大家可以根据实际情况来选择固定方法。选择冷冻固定方法后续我们可以直接进行冷冻切片并且用冷冻电镜对样品进行分析。该方法能够最大化接近样本生活状态，但是由于没有经过重金属染色，样品对比度不高，影响成像效果，并且不可以常温长期保存。

 

因此现实应用中，人们更多地选择高压冷冻固定后利用冷冻替代仪器对样品进行处理，在样品处理的同时逐步升温至室温，常温包埋、切片、染色以及常温透射电镜观察。该方法在最大化接近样本生活状态的同时，图像对比度好且有利于样品的长期保存。