• 其次是荧光色素，与免疫复合物耦合，可以利用显微镜进行观察目标结构。

图1：图中显示了间接免疫荧光的典型工作流程，上皮细胞粘附在盖玻片上生长。培养后细胞被固定，因此用化学交联剂（如甲醛）将其杀死。再用清洁剂进行透化处理，使抗体穿过细胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白来进行封闭，可减少抗体与非靶向结构的非特异性结合，从而减少假阳性信号。接下来与一抗进行孵育，特异性识别靶向分子上的表位。在二个培育步骤中，应用荧光耦合二抗，与一抗结合来实现靶向结构的可视化观察。抗体孵育后，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料进行细胞核染色。在显微镜载玻片上涂有封固介质（例如Mowiol或Prolong Gold）的盖玻片后，IF即已准备好进行显微镜观察。

直接与间接免疫荧光                                

根据实验类型的不同，有两种不同的IF变体可以使用：一种是直接IF或一级IF，一种具有特异性的一抗，能够与荧光色素连接用于结合靶向结构并实现直接可视化观察。

二种变体是指间接或二级IF，这种变体需要采用两步式培育。首先，特异性一抗识别靶向结构。然后应用与一抗特异结合的荧光色素耦合二抗。这种特异性是通过引导二抗抵御产生一抗的物种而获得的（见‘抗体和荧光色素’章节）。比较两种IF变体可见两者各有不同的优缺点：

通过耦合一抗和荧光色素，耗时的清洗和培育步骤被省略，所以直接IF比间接IF更快。因此，直接IF更易于处理，适合于在标准IF实验中（例如在临床实践中）对样本进行快速分析。但使用一种功能良好且对其抗原高度敏感的一抗。这同时也是一个缺点，因为荧光耦合和验证的一抗成本较为高昂。此外，每个靶向结构都需要一个单独的一抗，与间接IF相比，抗体与直接IF中的荧光色素的连接限制了设计实验的灵活性。

这种灵活性是间接IF的显著优势之一。通常在IF反应过程中，同一样本都会有几个不同的靶结构需要实现可视化观察，因此为每个靶向分子选择一个离散的荧光色素。

在间接IF中，不同的荧光耦合二抗可以与不同的一抗结合（当然还要考虑到物种的反应性）。相较之下，如果想在直接IF中对靶向结构“玩”颜色组合，则需要为每一种颜色使用单独的一抗。间接荧光的另一个优点是二抗的信号放大。多个二抗分子可与一个一抗结合来实现荧光增强，这意味可减少使用一抗。

间接IF的工作流程可能需要花费更多时间，但由于一抗和二抗能够组合而且整个操作过程的经济性更高，因此间接荧光成为了绝大多数研究人员的方法。

图2：有两种方法通过免疫荧光显示靶向结构：在两种变体中，一种特异的一抗用于识别靶分子上的特定表位。

在此图中，目标分子由几个相同的蛋白质亚单位（=大分子）组成，因此会在每个亚单位上表现出几个相同类型的表位。

为方便简化，此处只描绘了一个表位。

直接IF中，一抗直接连接到荧光色素，在显微镜下观察靶向结构。

间接IF中，荧光耦合二抗在二培育步骤中使用，从而专门对一抗进行标记。因为多个二抗分子可以结合到一个一抗上，所以选择抗体和荧光色素的灵活性更大，并能够进一步放大信号。抗体与荧光ses色素                                 

高质量的IF染色当中，很重要的工具是良好的一抗。同时，几乎每种细胞类型中的每种蛋白质都有一种或几种市售抗体。但此处需要强调若干重要注意事项。

要根据IF染色来做出准确的科学或临床声明，就确保一抗对其目标抗原的特异性。在操作中，研究人员不应完全依赖商业供应商的说明。应根据之前的使用经验以及文献中确认有效的一抗来进行抗体选择。查看制造商网站上的抗体数据表，查看IF染色的可用图片并与自身期望相比较，或者与其他已发布的插图进行比较。注意抗体的克隆号，因为单克隆抗体只与一个表位特异性结合，而多克隆抗体可识别多个表位，因此有可能存在非靶向结构的非特异性标记。所以，特异性较高且性能较优的单克隆抗体通常更昂贵，但也能获得更好的效果。

如希望开展多色间接IF实验，则不同的一抗衍生自不同的物种，以便在之后通过荧光耦合二抗来区分免疫复合体（见表1）。比如，您希望使用小鼠衍生的抗体抗蛋白A、兔衍生的抗体抗蛋白B和大鼠衍生的抗体抗蛋白C来实施IF检查。在选择二抗时记住，每种抗体都只能特定识别一种一抗。此外，在这三种二抗的例子中，荧光色素的波长光谱不同，以便在显微镜分析中辨别荧光信号。如今，可以买到与荧光色素相连的二抗，其波长范围从紫外线到红外线，几乎可以针对任何物种的一抗。因此，研究人员目前仅受到现有显微镜（滤光片组、激发激光器）配置的限制。利用新型的激光器，可以扩展红外一区的信号（图一、二）。